1.注意要點
（1）探針蛋白的本質(zhì)與相互作用蛋白的來源：探針蛋白的本質(zhì)：是全長蛋白、相互作用相關的結構域，甚至是化學合成的較小的生物活性片段。相互作用蛋白的來源：已知內(nèi)源性表達探針蛋白的細胞系是尋找與其相互作用蛋白的理想實驗材料。
（2）細胞裂解物的制備：成功制備細胞粗提物的關鍵因素包括：細胞的裂解方式；pH的控制；溫度；避免蛋白的降解。這些都需要在預實驗中多次重復來優(yōu)化細胞裂解條件。提取重組蛋白有時不必破碎細胞。例如，許多高表達的哺乳細胞系（尤其是中國倉鼠卵巢細胞，CHO細胞）和酵母細胞株（如Pichiapastoris）已經(jīng)被改造得可以分泌重組蛋白，因而可以直接從細胞條件培養(yǎng)基和培養(yǎng)濾出液中純化重組蛋白。使用這些方法很重要的一點是要盡可能快地濃縮大量的細胞條件培養(yǎng)基，使之盡快進入“無蛋白酶的環(huán)境”。
2.疑難分析解答
（1）結合過程中的參數(shù)：發(fā)現(xiàn)和證實蛋白質(zhì)的相互作用，與這些蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下相互作用的穩(wěn)定程度密切相關。這種穩(wěn)定程度決定了我們采用什么樣的體外結合條件。在自然狀態(tài)下那些參與細胞結構的蛋白質(zhì)相互作用往往是極其穩(wěn)定的，而在酶作用或蛋白轉(zhuǎn)運過程中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用卻短暫而不穩(wěn)定。
穩(wěn)定的蛋白質(zhì)相互作用能夠在較長的時間中仍保持相互作用關系，是zui容易用GST沉降實驗證實或發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)相互作用。對于這些較強的蛋白質(zhì)相互作用我們可以在較廣泛的結合條件下都能夠得到結果，往往我們常選用強離子濃度的緩沖體系避免非特異的蛋白質(zhì)相互作用，從而降低假陽性的出現(xiàn)。如果蛋白復合體相互作用較弱，具有較高的解離常數(shù)，那么我們常通過pH、離子強度以及不同的緩沖體系來調(diào)整蛋白質(zhì)的體外相互作用體系。
用GST沉降實驗來證實和探索自然中短暫而弱的蛋白質(zhì)相互作用，則是一項較為困難的實驗。這種蛋白質(zhì)的相互作用往往很難用GST沉降實驗類似的方法來完成。因為在實驗過程這種蛋白質(zhì)相互作用很可能就發(fā)生了解離。而這種短暫而弱的相互作用往往發(fā)生在酶發(fā)揮活性和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運過程中，在這些過程中常需要其他輔助因子的存在以及能量的參與（如NTP的水解產(chǎn)生的能量）。因此，要用GST沉降實驗完成短暫而弱的蛋白質(zhì)相互作用分析，就應該在反應體系中加入恰當?shù)妮o助因子以及能量，模擬一個和自然狀態(tài)很接近的相互作用體系。
（2）蛋白復合物的洗脫
在鑒定誘餌蛋白和靶蛋白過程中，需要將蛋白復合物從標簽蛋白發(fā)揮親和作用的基質(zhì)上洗脫下來，SDS-PAGE的上樣緩沖液和標簽蛋白的競爭物都能夠作為洗脫工作液。SDS-PAGE的上樣緩沖液作為洗脫工作液往往具有更強的洗脫能力，但是也會導致蛋白復合物的變性。另外，上樣緩沖液可以從基質(zhì)上洗脫下能和親和基質(zhì)發(fā)生強相互作用的非特異結合蛋白質(zhì)以及導致基質(zhì)的脫落，這些都會影響后續(xù)的鑒定分析。而標簽蛋白競爭性洗脫工作液，能夠特異的洗脫下誘餌蛋白-靶蛋白復合物，而且還是一種非變性的洗脫方法，能夠保持蛋白質(zhì)復合體的自然空間狀態(tài)，有利于某些隨后的分析。
另外一種洗脫方法能夠選擇的將靶蛋白洗脫下來，而保持誘餌蛋白仍和親和基質(zhì)相連。這種方法常采用步進式的增強鹽離子濃度或降低pH。這種方法也是一種蛋白質(zhì)非失活的洗脫方法，同時還能夠提供蛋白質(zhì)相互作用強弱的相關消息。細胞
（3）沉降實驗中對照的設立
在所有沉降實驗中對照實驗的設立都是必須的。在陰性對照實驗中只加入親和基質(zhì)和靶蛋白混合液，而不加誘餌蛋白，從而能夠幫助排除和親和基質(zhì)發(fā)生非特異結合的假陽性。在另一組陰性對照實驗組中，只有親和基質(zhì)、誘餌蛋白和無靶蛋白的蛋白混合液，從而能夠幫助排除和誘餌蛋白中的標簽蛋白非特異結合的假陽性，這一組對照實驗組也能夠作為陽性對照，說明親和基質(zhì)能夠有效的捕捉帶標簽的融合誘餌蛋白。
在線客服
